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PCR實驗常用試劑——DNA聚合酶

點擊次數:41   發布時間:2024/1/28 23:36:34

 PCR相關實驗在現代生命科學研究中發揮著重要作用。在PCR相關實驗中,會用到各種酶試劑,這些試劑關系到實驗的成功與否。其中,DNA聚合酶在DNA和RNA的操控、合成和分析中都發揮著難以替代的作用,成為科學家們揭示分子生物學奧秘的有力的工具。

本期內容,盤點PCR實驗中常用的DNA聚合酶試劑。

DNA聚合酶(DNA Polymerase)參與DNA分子的合成過程。它在細胞中的主要功能是在DNA復制中負責合成新的DNA鏈。

DNA聚合酶使用DNA模板上的信息,根據堿基互補配對原則(A-T,C-G配對),從5'→3',即從新鏈的5'端到3'端進行,在新鏈上加入互補的核苷酸。DNA聚合酶只能在已存在的DNA鏈上進行合成,因此需要一個起始點,稱為引物(primer),來提供3'端的OH基團,該過程一直持續到整個DNA鏈被復制完成。

除了PCR實驗中,在生物體的細胞中,也有DNA聚合酶的參與,例如,幫助DNA損傷修復和維護基因組的完整性。

​DNA聚合酶是一類酶的總稱,有多種種類,每種都具有不同的特性和應用。
 

Taq DNA聚合酶

來源

從耐熱細菌Thermus aquaticus中分離得到。

特點

耐熱性:Taq DNA聚合酶的適宜工作溫度通常在70°C至75°C之間。這使得Taq DNA聚合酶非常適合PCR反應,因為PCR需要在每個循環中通過高溫步驟來分離DNA鏈。

5'→3'聚合酶活性 Taq DNA聚合酶具有5'→3'聚合酶活性,即它能夠在DNA鏈的5'端到3'端方向上合成新的DNA鏈。

沒有3'→5'外切酶活性 與一些其他DNA聚合酶不同,Taq DNA聚合酶不具備3'→5'外切酶活性,這意味著它缺乏校正能力,容易引入突變。因此,在PCR反應中,Taq DNA聚合酶的錯誤率相對較高。

DNA模板依賴性:Taq DNA聚合酶對于DNA模板的依賴性較強,需要引物(primer)提供3'端的OH基團,作為新DNA鏈的起始點。

Pfu DNA聚合酶

來源

從嗜熱古細菌Pyrococcus furiosus中分離得到。

特點
高度的3'→5'外切酶活性:
Pfu DNA聚合酶表現出高度的外切酶活性,使得其能夠進行校對,糾正PCR反應中可能發生的錯誤。這有助于提高擴增產物的準確性。

高保真度:由于其強大的外切酶活性,Pfu DNA聚合酶在PCR反應中具有更低的錯誤率,提供高度保真的DNA合成。

溫度適應性:Pfu DNA聚合酶在較高的溫度范圍內(通常在72°C至75°C)表現出較高的活性,適用于PCR反應的高溫步驟。

缺乏5'→3'外切酶活性:與一些其他聚合酶不同,Pfu DNA聚合酶通常不具備5'→3'外切酶活性,因此不會引入額外的5'端修飾。

大腸桿菌DNA聚合酶

來源

從大腸桿菌(Escherichia coli)中分離得到。

特點
多功能性:
大腸桿菌中有三種不同類型的 DNA 聚合酶,即 DNA 聚合酶 Ⅰ、DNA 聚合酶 Ⅱ 和 DNA 聚合酶 Ⅲ,它們分別簡稱為 PolⅠ、PolⅡ 和 PolⅢ。PolⅠ 和 PolⅡ 的主要功能是參與 DNA 的修復過程,而 PolⅢ 的功能看來是同 DNA 的復制有關。

基因克。大腸桿菌DNA聚合酶在基因克隆中廣泛應用,用于合成DNA片段、連接DNA末端,是DNA構建的關鍵工具。

PCR輔助:在PCR實驗中,某些大腸桿菌DNA聚合酶的外切酶活性,比如:Klenow片段,可以用于擴增產物末端的修飾,例如A添加(A-tailing)。

低錯誤率:大腸桿菌DNA聚合酶通常具有相對較低的錯誤率,這在一些實驗中是需要考慮的因素。然而,與一些高保真度的DNA聚合酶相比,其準確性可能較低。


T4 DNA聚合酶

來源

來自噬菌體T4的DNA聚合酶,屬于T4 DNA復制和修復機制中的關鍵酶。

特點

5'→3'聚合酶活性:T4 DNA聚合酶主要表現為5'→3'聚合酶活性,即在合成新的DNA鏈時,從DNA鏈的5'端到3'端方向進行。

3'→5'外切酶活性:T4 DNA聚合酶還具有3'→5'外切酶活性,能夠修剪單鏈DNA的3'末端。在反向切除DNA片段時非常有用,例如在DNA修復和重組過程中。

缺乏核酸內切酶活性:與一些其他T4 DNA復制酶不同,T4 DNA聚合酶通常不具有核酸內切酶活性,因此不會切割雙鏈DNA。

依賴于引物:T4 DNA聚合酶在DNA合成時需要引物提供3'端的OH基團,因此通常在反應中需要引物的引導。

DNA末端修飾:T4 DNA聚合酶可用于在DNA末端進行修飾,例如通過添加dA(腺嘌呤)或dG(鳥嘌呤)來形成A懸垂末端或G懸垂末端。

好物推薦

PCR實驗

德國Minerva Biolabs公司生產的 Taq DNA聚合酶是一種高效的5‘→3’聚合酶,沒有3‘→5’外切核酸酶活性。在72℃和pH9的條件下,MB Taq DNA聚合酶達到其高水平的活性,能夠在30秒內擴增1 kb DNA。

 

Taq的活性在室溫時被阻斷,例如在準備樣品時。當溫度高于70℃時,Taq聚合酶的抑制被逆轉。在94℃2分鐘后聚合酶達到活化。MBTaq DNA聚合酶帶有10x緩沖液,能獲得更大產率和靈敏度,這應符合大多數標準應用。

 

MB Taq 熱啟動DNA聚合酶推薦使用/范圍:

常規和多重PCR;實時PCR;T/A克;生物素/地高辛或放射性核苷酸進行DNA標記;雙鏈或單鏈標準DNA測序

原創作者:北京締一生物科技有限公司

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